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An. 6. Enc. Energ. Meio Rural 2006

 

Caracterização da biomassa isolada de processos fermentativos de produção de etanol para uso como biocombustíveis

 

 

Claudia. Steckelberg; Maria da Graça Stupiello. Andrietta; Sílvio Roberto Andrietta

Universidade Estadual de Campinas - CPQBA - Divisão de Biotecnologia e Processos - Caixa Postal 6171 - CEP: 13082-970 - Campinas/SP l:claudia@cpqba.unicamp.br

 

 


RESUMO

Este trabalho teve como objetivo isolar e caracterizar linhagens de leveduras isoladas de diferentes processos de fermentação alcoólica para produção de biocombustível. O atributo estudado foi à característica fermentativa das linhagens. As leveduras isoladas foram ainda identificadas, utilizando metodologia de taxonomia numérica (GRIFFITHS, 1981). Os resultados mostraram que em relação às características fermentativas embora as cepas embora apresentem algumas diversidades de comportamento todos os isolados foram considerados apropriados para a produção de etanol. Todas as linhagens isoladas pertencem ao gênero Saccharomyces. Dentro desse gênero foram encontradas representantes das seguintes espécies: chevalieri, coreanus cerevisiae. Se for considerada a classificação segundo BARNET (1992) todas as leveduras são representantes de S. cerevisae.

Palavras chaves: Etanol, biomassa, levedura, fermentação alcoólica, taxonomia numérica


ABSTRACT

This study has had the purpose of enhancing the knowledge on the dominant strains of ethanol fermentation process biomass to use as biofuel. The attributes studied were: numerical taxonomy (GRIFFITS, 1981) and fermentative performance. The results have showed that all strains have presented good fermentative characteristics. All strains have been classified as Saccharomyces. In this genus were found the follow species: chevalieri, coreanus cerevisiae. If the classification according BARNET (1992) is considered, all of them are representative of S. cerevisae.


 

 

Introdução

O Brasil possui uma frota expressiva de automóveis movidos a álcool. Em 2003 o Brasil lançou o automóvel flexfuel (opera com dois diferentes combustíveis, o etanol e a gasolina). Em 2004 esse tipo de automóvel representou 21,6 do total de carros vendidos. Para 2005 serão responsáveis por 61,7% dos carros vendidos (ROSA, 2005).

Com esse novo panorama as unidades do setor sucroalcooleiro privilegiam a produção de etanol e desapertam o interesse da comunidade científica no entendimento da microbiologia das dornas de fermentação. O acompanhamento da dinâmica populacional das cepas de levedura em processos de fermentação alcoólica pode fornecer informações valiosas sobre o processo e conseqüentemente sua otimização. As informações obtidas podem ser utilizadas na seleção de leveduras "nativas" com alto potencial fermentativo e na adequação dos processos às suas necessidades através da elaboração e melhoramento de projetos e também da correção de condutas operacionais inadequadas (STROPPA et al., 2000).

As ferramentas utilizadas para a identificação de leveduras incluem desde as taxonomias clássicas (LODDER, 1970) e numéricas (GRIFFITHS, 1981) até as análises sofisticadas de cariotipagem (CARLE & OLSON, 1984; SCHWARTZ & CANTOR, 1984; CHU et al., 1986). Embora toda essas técnicas tenham reconhecido valor como instrumento de estudo não fornecem informações sobre o desempenho fermentativa da levedura.

Segundo ANDRIETTA et al. (1999), o conhecimento da cinética é essencial para o entendimento da dinâmica de população de leveduras nas dornas de fermentação.

Em uma unidade pode ocorrer queda no rendimento durante o processo, sem que o motivo seja conhecido. A detecção de leveduras ao longo do processo e a sua caracterização fermentativa será importante neste caso, pois fornecerá subsídios para verificar se a diminuição do rendimento é devido à contaminação ou à falhas de operação, ou má qualidade da matéria-prima (RODRIGUES & ANDRIETTA, 1995).

ANDRIETTA et al. (1995), propuseram uma diferenciação entre leveduras baseada em seu potencial fermentativo. Esta técnica foi utilizada no desenvolvimento de um sistema de classificação, designado "capacidade fermentativa" (ANDRIETTA et al., 1999), que separa as leveduras em diferentes grupos de acordo com a associação de seis parâmetros de produção específica e características cinéticas.

Esse trabalho se propõe a isolar e caracterizar, quanto às características fermentativas e descritas por ANDRIETTA et al, 1995 e identificação utilizando metodologia descrita por GRIFFITS, 1981, leveduras isoladas de processos de fermentação alcoólica com características peculiares quando ao tipo de processo.

 

Material e métodos

Isolamento das linhagens de leveduras: As linhagens de leveduras foram isoladas durante os anos de 1994 a 1998 de ambientes de dorna de fermentação das seguintes unidades produtoras de etanol brasileiras : Usina Alvorada Açúcar e Álcool Ltda (MG); Unialco S.A. Álcool e Açúcar (SP); Irmãos Franceschi Ltda (SP); Diana Destilaria de Álcool Nova Avanhandava (SP); Jalles Machado S.A. Açúcar e Álcool (GO); Fundação Sinhá Junqueira (SP); Goiasa (GO); Cia. Açucareira Vale do Rosário (SP); Açúcareira Corona S.A. (SP); Usina Costa Pinto S.A. (SP); Açúcar Guarani (SP); Destilaria Andrade S.A. (SP); Destilaria de Álcool Califórnia (Dacal) (SP); Dacalda Açúcar e Álcool Ltda. (PR); Alcoeste Destilaria Fernandópolis S.A. (SP); Cooperativa Agropecuária Rolândia ltda. (PR); Mauri - produção de fermento; Usina Barra Grande de Lençóis (SP); Usina Santa Cruz (RJ) e Clealco Açúcar e Álcool (SP). Foram avaliados esses parâmetros para duas leveduras comerciais (Y904 e Y167).

O isolamento foi realizado utilizando técnica de espalhamento em superfície em WL nutrient medium (Difco 0424-17-9). As placas foram incubadas por r 7 dias a 32º C. by 7 days at 32ºC As culturas foram mantidas a 4 ºc em PDA (Difco 0549-17-9) coberto com óleo mineral esteril. Essas leveduras fazem parte da coleção de cultura da Divisão de Biotecnologia e processos do CPQBA/UNICAMP.

Obtenção dos parâmetros cinéticos: Os parâmetros cinéticos obtidos para cada cepa foram: Yx/s = g massa celular produzida (massa seca)/g açúcar; VCS = g açúcar consumido/Lxh; NCO = % nível de conversão de substrato; µmáx = velocidade específica máxima de crescimento (h-1); Ø = g etanol produzido/Lxh; Yp/s = g etanol produzido/ g açúcar.

Os parâmetros foram obtidos a partir de fermentação conduzidos em frascos agitados (Erlenmeyers de 250 ml com 100 ml de meio de cultivo estéril) a 32°C, 150 rpm e 24 horas. O meio de cultivo utilizado foi composto de (g/l): 150g de glicose; 5g de KH2PO4; 5g de NH4Cl; MgSO4.7H2O; 1g de KCl e 6g de extrato de levedura.

Metodologia analítica: A analise de açúcar foi feito utilizando método enzimático da glicose oxidase (STECKELBERG, 2001), o etanol foi obtido método colorimétrico (SALIK & POVH, 1993). A massa celular foi obtida por diferença de peso (RODRIGUES & ANDRIETTA, 1995) e o µmax através de crescimento celular medido por absorbância (RODRIGUES & ANDRIETTA, 1995) .

Taxonomia numérica: Segundo descrito por GRIFFITHS, 1981.

 

Resultado e Discussão

A Tabela apresenta os resultados para as 21 cepas de leveduras estudadas.

Os valores apresentados na Tabela 1 confirmam uma expectativa no que diz respeito à população de leveduras presentes nas dornas de fermentação de unidades industriais. Embora com variações previsíveis, todas as leveduras apresentaram característica fermentativas adequadas ao processo industrial. No que se refere à identificação, os resultados também estão dentro do esperado para leveduras de ambientes de fermentação alcoólica. Com exceção de duas delas (Dacalda e Barra Grande), as quais não foram identificadas, todas as leveduras isoladas são pertencentes ao gênero Saccharomyces. BARNET (1992) agrupou algumas das espécies pertencentes ao gênero Saccharomyces na espécie cerevisae. Esse gênero passou a contemplar apenas 10 espécies. Em função disso as espécies coreanus chevalieri a partir de 1992 passam a fazer parte da espécie cerevisae . Partindo dessa nova classificação pode-se afirmar que todas as leveduras identificadas são denominadas Saccharomyces cerevisae. Avaliando a metodologia utilizada para descrever as características fermentativas é possível afirmar que embora as leveduras sejam classificadas como Saccharomyces cerevisae elas devem pertencer a diferentes "strains".

Os parâmetros cinéticos apresentados na Tabela 1 quando analisados de forma criteriosa são divididos em três blocos. O primeiro construído a partir dos valores de rendimento de biomassa (YX/S) e em etanol (YP/S), o segundo a velocidade de fermentação (NCO, VCS e Ø) e o terceiro com a velocidade de crescimento celular (µmax). Uma análise em conjunto destes parâmetros é necessária para agrupar as leveduras que já em uma primeira analise apresentam as características fermentativas adequada para uso industrial. O principal parâmetro a ser observado para que uma linhagem seja considerada adequada à aplicação industrial é o rendimento em etanol (YP/S). Pelos resultados mostrados observa-se que as linhagens estudas apresentaram valores para este parâmetro que variaram entre 0,4399 a 0,4712, enquanto os valores desejados são aqueles superiores a 0,46. Sendo assim, algumas linhagens estudadas, tais como as isoladas da Usina Barra Grande, Usina Guarani, Vale do Rosário e outras, as quais apresentaram valores bem abaixo daquele de referência. Destas três linhagens a isolada da Usina Guarani apresenta valores de parâmetros vinculados a velocidade de fermentação abaixo dos obtidos pelas outras cepas (NCO, VCS e Ø). Já a isolada na Usina Vale do Rosário apresenta o parâmetro vinculado ao crescimento microbiano abaixo daquele apresentado pelas outras linhagens.

Das linhagens estudadas, as que merecem destaque são as isoladas da Dacalda, Dacal e Bonfim, por apresentarem valores dos três grupos de parâmetros satisfatórios, sendo estas linhagens classificada pela taxonomia numérica como sendo não identificada, S. cerevisae e S.chevalieri, respectivamente. É interessante ser observado que a linhagem de apresentou o melhor desempenho (Dacal) e desempenho mais inadequada (Vale do Rosário) foram classificadas como pertencetentes a espécie cerevisae. O mesmo ocorre com as linhagens isoladas da Usina Guarani e Bonfim, uma vez que as duas linhagens foram classificadas como exemplares pertencentes a espécie chevalieri e apresentaram desempenhos antagônicos no que diz respeito a característica fermentativa. Essas afirmações reforçam a hipótese expostas anteriormente que postula que todas as leveduras são exemplares de S. cerevisae , só que pertencentes a diferentes "strains"

 

Bibliografia

ANDRIETTA, S.R.; ANDRIETTA, M.G.S.; RODRIGUES, M.I. Método de caracterização de leveduras de processo utilizando parâmetros cinéticos e produção específica. STAB - Açúcar e Álcool e Subprodutos, v.13, n.4, p.22-25, 1995.

ANDRIETTA, S.R.; MIGLIARI, P.C.; ANDRIETTA, M.G.S. Classificação de cepas de levedura de processos industriais de fermentação alcoólica utilizando capacidade fermentativa. STAB- Açúcar e Álcool e Subprodutos, v.17, n.5, p.54-59, 1999.

BARNETT, J.A. The taxonomy of genus Saccharomyces Meyen ex Press: a short review for non-toxonomists. Yeast, v.8, p.1-23, 1992.

ROSA, G.R.. O Sucesso do Flex-Fuel. Anuário Brasileiro da Cana de Açúcar 2005 p.39-40, 2005.

CARLE, G.F.; OLSON, M.V. Separation of chromosomal DNA molecules from yeast by orthogonal-field-alternation gel electrophoresis. Nucleic Acid Research, n.12, p.5647-5664, 1984.

CHU, G.; VOLLRATH, D.; DAVIS, R.W. Separation of large DNA molecules by countour-clamped homogeneus eletric fields. Science, 234, p.1582-1585, 1986.

GRIFFTHS, A.J. A numenclature of the yeast . Antonie van Leeuwenhoek. 47: 547-563,1981.

LODDER, J. The Yeast. 1 ed. North-Holland Publishing Company. London, 1970. 815 p.

RODRIGUES, M. I. & ANDRIETTA, M. G. S. Controle da fermentação alcoólica através de testes microbiológicos e bioquímicos. Campinas. Faculdade de Engenharia de Alimentos/UNICAMP, 1995. 54p. (curso de extensão).

SALIK, F.L.M.; POVH, N.P. Método eletrofotométrico para determinação de teores alcoólicos em misturas hidroalcoólicas. In: Congresso Nacional da Stab, 5, Águas de São Pedro, 1993. Anais, p.262-263, Piracicaba.

SCHWARTZ, D.C.; CANTOR, C.R. Separation of yeast chromosome-sized DNAs by pulsed field gradient gel electrophoresis. Cell, v.37, p.67-75, 1984.

STECKELBERG, C. Caracterização de leveduras de processos de fermentação alcoólica utilizando atributos de composição celular e características cinéticas. Tese de Doutorado. Faculdade de Engenharia Química de Campinas, 2001.

STROPPA, C.T.; ANDRIETTA, S.R.; ANDRIETTA, M.G.S., SERRA, G.E. Dinâmica populacional de leveduras em processos industriais de fermentação alcoólica. In: Simpósio Nacional de Fermentação, 13. Anais, doc.4, 2000.